TA克隆專業(yè)化的藝術(shù)

 　　TA克隆技術(shù)（TA cloning）利用Taq聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）活性，但卻不具有3'-5'端外切酶校準(zhǔn)活性的特點(diǎn)，可在PCR產(chǎn)物的3'端加上一個非模板依賴堿基“A”。pMD18-T是一種克隆PCR產(chǎn)物的載體，它是由pUC18載體在Xba I和Sal I識別位點(diǎn)間插入一個EcoR V位點(diǎn)，然后用EcoR V進(jìn)行酶切使質(zhì)粒線性化，并在它的3'端添加“T”構(gòu)建而成。因其3'端帶有一個突出的“T”尾，能地與帶“A”尾的PCR產(chǎn)物連接，極大地提高了克隆的效率。TA克隆是目前克隆PCR產(chǎn)物zui簡便、快捷的方法。
 
　　1.TA克隆技術(shù)只需4個步驟：①擴(kuò)增目的PCR產(chǎn)物；②制備T克隆載體；③基因合成產(chǎn)物直接克隆至T載體上④轉(zhuǎn)化并篩選重組子。 PCR２.轉(zhuǎn)化后無克隆菌產(chǎn)生轉(zhuǎn)化過程有問題或感受態(tài)細(xì)胞失活,可通過轉(zhuǎn)化pUC18/19等未切割的可用于抗性篩選的質(zhì)粒，基因合成３.插入對照DN段的陽性率低TA克隆10×快速連接緩沖液稀釋不當(dāng)提供的T4 連接酶緩沖液為十倍濃度，10μl 反應(yīng)體積加1μl T4 連接酶緩沖液連接反應(yīng)存在問題連接緩沖液只有低的活性。10×快速連接緩沖液含有ATP，溫度波動ATP 易降解。使用一次性分裝的緩沖液，避免其反復(fù)凍化定點(diǎn)突變通過凝膠比較連接的和未連接的DN段并檢查分子量標(biāo)準(zhǔn)DN段是否被連接成高分子量的片段，用大約20ng DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)（如Lambda DNA/Hind III 分子量標(biāo)準(zhǔn)）TA克隆建立一個連接反應(yīng)以檢測連接酶及緩沖液的活力T 突出端丟失，引起載體平端連接，因而藍(lán)色菌落數(shù)高于白色菌落數(shù)避免核酸外切酶的引入，降解T 突出端。只使用無外源核酸酶的T4 連接酶，多肽合成采用插入對照DN段，連接轉(zhuǎn)化時白色克隆菌數(shù)低于60％。 10×快速連接緩沖液稀釋不當(dāng)提供的T4 連接酶緩沖液為十倍濃度，10μl 反應(yīng)體積加1μl T4 連接酶緩沖液T 突出端丟失，TA克隆引起載體平端連接，因而藍(lán)色菌落數(shù)高于白色菌落數(shù)。避免核酸外切酶的引入，降解T 突出端。只使用系統(tǒng)自己提供的T4 連接酶，這種連接酶外切酶活力zui低連接溫度太高連接溫度過高（>28℃）可使背景增加，使重組克隆菌減少。降低連接溫度可以提高白斑率PCR 片段很多沒有A 尾。將PCR 產(chǎn)物純化后進(jìn)行加尾反應(yīng)。樣品純化后進(jìn)行連接反應(yīng)插入片段：載體比例不理想。凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物的完整性及產(chǎn)量，優(yōu)化插入片段多個PCR 產(chǎn)物被克隆進(jìn)pGM-T 或pBS-T 載體凝膠純化目的PCR 產(chǎn)物PCR 產(chǎn)物連接時白色菌落數(shù)很少或根本沒有。
 
　　TA克隆 10×快速連接緩沖液稀釋不當(dāng)提供的T4 連接酶緩沖液為十倍濃度，10μl 反應(yīng)體積加1μl T4 連接酶緩沖液連接孵育時間不夠長連接過夜可得到理想結(jié)果PCR 產(chǎn)物中含有抑制連接的成分，導(dǎo)致連接的失敗將PCR 產(chǎn)物和連接反應(yīng)對照混合，觀察是否存在抑制效應(yīng)。如懷疑TA克隆有抑制成分存在，應(yīng)重新純化PCR 產(chǎn)物PCR 產(chǎn)物沒有3’-A 突出端，不能連接。并非所有DNA 聚合酶都產(chǎn)生3’-A 突出端，如Pfu酶的PCR產(chǎn)物為平端。平端PCR產(chǎn)物可先通過聚合酶及dATP 進(jìn)行加尾反應(yīng)產(chǎn)生3’-A 突出端，再與T載體連接，gene synthesis由于紫外燈過度照射形成嘧啶二聚體，PCR 產(chǎn)物不能連接。PCR 產(chǎn)物已經(jīng)插入，但未破壞lacZ 基因的翻譯框。插入片段：載體連接比例不理想TA克隆DNA 重排檢測大量克隆觀察重排是否是隨機(jī)的。如果是隨機(jī)重排，通過篩選可得到有目的DN片段的克隆菌，而如果所有克隆是一種重排方式，則需要使用修補(bǔ)缺陷的菌株保護(hù)插入片段，減少重排事件的發(fā)生PCR 連接反應(yīng)只產(chǎn)生白色克隆（沒有藍(lán)色克隆）氨芐失活，因而氨芐敏感菌可生長。檢查氨芐平板是正常制備并在一個月內(nèi)使用菌株（如*0）喪失F’因子檢測背景對照，如果菌落不是藍(lán)色的，則可能是宿主菌細(xì)胞丟失F’因子（假設(shè)acIqZ.M15 位于宿主菌的F’因子上，并使用正常平板）。TA克隆用于T-載體系統(tǒng)的感受態(tài)細(xì)胞一定要正確制備平板不適合藍(lán)白斑篩選。檢測背景對照，如果克隆菌不是藍(lán)色的，檢查平板是否含有氨芐/IPTG/X-Gal 以及是否新鮮。如平板有問題，重新制備新鮮平板含有目的PCR產(chǎn)物的克隆菌.
 
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